1
标准曲线 / 绝对定量
使用已知起始量 x 与 Ct 建立 Ct = slope × log10(x) + intercept。软件按“基因/检测项目”分别拟合，可将多条曲线叠加在同一图，并在图内显示方程与 R²。
log₁₀(x) = (Ct − intercept) / slope
x = 10(Ct − intercept) / slope
Efficiency = (10−1/slope − 1) × 100%
dsDNA copies/µL = ng/µL × 10−9 × 6.022×1023 / (bp × 660)
原液 copies/µL = copies/反应 ÷ 模板加入量 × 稀释倍数
- 每个检测项目至少 3 个不同浓度，建议 5–7 个梯度。
- Unknown / NTC 的检测项目名称必须与对应 Standard 完全一致。
- 建议 R² ≥ 0.98；本工具默认低于 0.95 判为风险。
- 扩增效率通常以 90%–110% 为理想，工具默认 80%–120% 为可接受边界。
2
2−ΔΔCt 法
先用内参校正样本间投入差异，再用校准组作为相对表达基线。
ΔCt = Cttarget − Ctreference
ΔΔCt = ΔCtsample − mean(ΔCtcalibrator)
Relative expression = 2−ΔΔCt
- 目的与内参基因扩增效率应相近且接近 100%。
- 校准组的组均值约为 1，但单个样本可上下波动。
- 生物学重复先逐个计算，再进行组别汇总。
3
双标准曲线法
分别用两条回归方程将目的与内参 Ct 换算成起始量，不要求两者扩增效率完全一致。
Qtarget = 10(Cttarget−btarget)/mtarget
Qref = 10(Ctref−bref)/mref
Normalized = Qtarget / Qref
两条曲线都必须覆盖待测样本 Ct 范围；超出标准曲线范围的外推结果会单独预警。
4
试剂评价
只有相同样本、投入量、引物和仪器条件的数据才能直接比较。反转录酶建议使用同一批 RNA；qPCR mix 建议使用同一批模板。
CV(Ct) = SD(Ct) / mean(Ct) × 100%
Detection rate = 有效 Ct 数 / 计划复孔数 × 100%
Relative yield = 2−(Ct−Ctbest matched) × 100%
推荐同时审阅扩增曲线、熔解曲线、NTC、标准品线性以及低浓度检出一致性。
5
加标回收率
同一系列、同一检测项目内，用加标样的实测值扣除基线样实测值，再除以已知加标量。多个加标水平时，以加标量为 x、回收量为 y 拟合回收曲线。
回收量 = 加标样实测值 − 基线样实测值
回收率 (%) = 回收量 ÷ 加标量 × 100%
回收曲线：回收量 = slope × 加标量 + intercept
- 基线可选择“未加标”或“NCS”，含义以试剂盒说明为准。
- 实测值留空时，软件调用“qPCR 定量分析”中同名检测项目的标准曲线由 Ct 反算。
- 默认 80%–120% 仅为可编辑筛查范围，不替代方法学验证标准。
- 公式参考：US EPA Method 1632A（Percent recovery = 100 × (A − B) / T）。
6
KQ101 Illumina 文库定量
用 S1-S6 的已知 pM 浓度建立 Ct 对 Log[pM] 的标准曲线，再按 420 bp 标准品与文库平均片段长度的比值校正荧光响应。
稀释文库初测 pM = 10(Ct − intercept) / slope
校正后稀释文库 pM = (420 bp / 文库平均长度 bp) × 初测 pM
原始文库 nM = 校正后 pM × 稀释倍数 / 1000
- 相邻标准品 ΔCt 应在 3.1-3.6，曲线 R² 应 ≥ 0.99，斜率应在 -3.6 至 -3.1。
- NTC 应比最低有效标准品晚至少 3 Ct；严重污染时结果标记为不可用。
- 同一文库建议使用两个不同稀释度，二者校正结果差异超过 10% 时预警。
- 依据：全式金 KQ101 Version 2.0 说明书。
7
本地项目与备份
V5 在当前浏览器保存多个实验项目，输入后约 0.7 秒自动保存。项目包含实验信息、阈值、所有原始 Ct、复孔排除标记和所选计算方法。
分析报告（XLSX / CSV）= 用于查看和分享结果
项目备份（.qpcr-project.json）= 用于恢复输入、继续分析
云端上传 = 否
- 更换浏览器、设备或网站域名时，本地项目不会自动同步。
- 使用“备份项目（可恢复）”保存输入，再用“恢复项目备份”继续分析。
- V5 可导入 V2、V3、V4 或 V5 项目备份；V4 项目请先在 V4 中备份，再在 V5 中恢复。
8
V5 合并工作流与浓度换算
在“qPCR 定量分析”内选择计算方法。统一 Excel 模板按工作表分别填写，未使用的表请删除示例行。合并分析报告包含本次已计算的方法、质控、公式、原始数据和图表。
原始文库 ng/µL = 原始文库 nM × 平均文库长度(bp) × 660 / 1,000,000
示例：10 nM × 500 bp × 660 / 1,000,000 = 3.3 ng/µL
ng/µL 是 qPCR 定量结果按双链 DNA 分子量得到的质量浓度换算值。长度使用含接头的完整文库平均长度；各有效稀释度分别换算后再取平均。Illumina 换算依据 ↗
修改数据、排除复孔或调整参数后，受影响的结果标记为“待更新”；重新计算后才能导出。小浓度自动增加小数位或使用科学计数法。